Allgemeine Methoden der Molekularbiologie

Trennung von speziellen Molekülen

Voraussetzung: gleichmäßig geladen

Auftrennung nach Größe und Ladung

umgekehrt proportional zur logarithmischen Größe des Moleküls, je größer desto langsamer

Kationen (+) -> Kathode (-)
Anionen (-) -> Anode (+)

Agarose: DNA/RNA
SDS-PAGE: Proteine

glykosidisch verbundene D-Galaktose & 3,6-Anhydrogalaktase

Matrix

Nukleinsäuren trennen in nicht denaturierenden, horizontalen Agarosegelen

je kleiner Moleküle desto höher Agarosekonzentration

Sukzedanfärbung
2 Farbstoffe werden nacheinander angesetzt

Hämalaun wird progressiv gefärbt: beim Erreichen des gewünschten Färbegrades wird die Färbung abgebrochen

Eosin wird regressiv gefärbt:
erst überfärbt, dann differenziert

natürlicher, farbloser Pflanzenfarbstoff aus Blauholz

durch Zugabe von Metallionen, z.B. Eisen entsteht positiv geladenes Hämalaun, das bei pH>3 blau ist

basisch, positiv geladen und bindet an negativ geladene, basophile Strukturen, z.B. Zellkerne (DNA)

Eosin Y/G: wasserlöslich, schwach sauer, gelb

Eosin S: wasserunlöslich/alkohollöslich, hohe Lichtbeständigkeit, wird in 70%igem EtOH gelöst, rot-orange, azidisch und negativ, wird von positiven Ladungen angezogen

färbt Zytoplasma rot

Zellkerne - blau

Zytoplasma - hellrot

Bindegewebsfasern - rot

Muskelgewebe - rot

Erythrozyten - orange

Knorpel - bläulich

3 Farbstoffe sukzessiv gefärbt

1. Weigerts Eisenhämatoxylin
2. Fastgreen
3. Safranin O

unterschiedliche Gewebetypen abhängig von ihren Ladungen in verschiedenen Farben angefärbt

Mischung Hämatoxylin und Eisenchlorid in HCl

basisches EH bindet in saueren Farblösungen an negativ geladene Gruppen, z.B. Nukleinsäuren im Zellkern

regressive Färbung

durch Eisensalze in der Farblösung ist die Bindung auch im sauren Milieu stabil

färbt Kerne blau-schwarz

Triphenylmethanfarbstoff

bindet im alkalischen pH elektrostatisch an basische AS-Seitenketten

färbt Histone, Collagen 1 und Cellulose

Darstellung von Muskel- und Bindegewebe in grün

auch als Lebensmittelfarbstoff verwendet

3,7-Diamino-2,8-dimethyl-5-phenaziniumchlorid

kationischer Farbstoff, positive Ladung bindet an negativ geladene, saure Proteoglykane

rot-orangener Farbkomplex

färbt Knorpel, Mucine und Mastzellen

Zellkerne - blau-schwarz

saure Proteoglykane - rot-orange

Muskelfasern und Bindegewebe - grün bis grün-blau

Southern: DNA

Northern: RNA

Western: Proteine

1. elektrophoretische Auftrennung von DNA/RNA/Proteinen

2. Transfer auf Blottingmembran

3. Blockierung

4. Probeninkubation

5. Detektion/Nachweis

Salpetersäureester der Cellulose, Schießbaumwolle

pros:
hohe Bindungsaktivität für DNA/RNA/Proteine
wenig Hintergrundsignale bei Detektion
reversible Färbung von Proteinen möglich (Ponceau-S)

contras:
keine kovalente Bindung
Bindung durch hydrophobe Wechselwirkungen
kleine Proteine können durch Membran
brüchig, mechanische Instabilität

am häufigsten verwendete Memvran bei WB

Teflonbasis

pros:
sehr hohe Bindungskapazität (170-430 μg/km²)
hohe mechanische und chemische Stabilität
Einsatz auch für die direkte Proteinsequenzierung
zugänglich für Färbungen

contras:
meiste Färbungen nicht reversibel
hydrophob -> wird durch Behandlung mit Methanol/Ethanol gemindert

Blotting Membran wird auf Geloberfläche gelegt

Übertragung der Moleküle durch Diffusion aus Gel

geschieht allseitig -> 2. Membran kann auf die Unterseite des Gels gelegt werden (gespiegelter Transfer)

Temperaturerhöhung -> Beschleunigung der Diffusion

beruht auf Kapillareffekt (Kohäsion und Adhäsion, Flüssigkeiten steigen entgegen Schwerkraft)

Kapillarkraft saugt aus einem Vorratsgefäß Puffer über Saugpapiere durch Gel und Blottingmembran in einen Stapel trockenes Papier

Moleküle aus Gel werden mitgeführt und adsorbieren an Blottingmembran

Transfer zeitintensiv

Druck als treibende Kraft

Apparatur mit porösem Träger, auf einer Seite versiegelt

Unter-/Überdruck erzeugt, treibt Puffer mit Molekülen auf Membran

pros:
Zeitgewinn (20-45min)
Vermeidung von Rücktransfer

contras:
Gel kann zusammenbrechen
teure Apparatur, gewisse Erfahrung im Umgang nötig

gleiches Prinzip wie Wanderung von DNA/RNA und Proteinen in einem elektrischen Feld

Tankblot (Wet-Blot)

Semidry-Blot

pros:
besserer Transfer großer Proteine

contras:
Schwankungen im elektrischen Feld können zu unterschiedlichen Blotting-Effizienzen führen
großes Puffervolumen notwendig
externe Kühlung notwendig

pros:
geringere Schwankungen des elektrischen Feldes
geringere Puffermenge ausreichend
meine externe Kühlung nötig

contras:
schlechter Transfer großer Proteine

beeinflusst durch die Elutions-Effizienz (Transfer-Effizienz) von Proteinen aus der Gel-Matrix, sowie die Bindungsfähigkeit der Membran

abhängig von der Konzentration an Acrylamid und Quervernetzer, sowie der Dicke der Gele

generell: je geringer die Prozentigkeit und je dünner die Gele, desto einfacher der Transfer

enthält Methanol oder Ethanol

dies erhöht die Bindung der Proteine an die Membranen und sorgt für Kühlung, wodurch das Anschwellen der Gele reduziert wird

Ponceau S: reversibel, geeignet, wenn Membran weiterverwendet werden

Coomassie Brilliant Blue: keine Hintergrundfärbung, alle Oligopeptide werden erfasst (<10-15aa)

Silber-Färbung: besonders hohe Empfindlichkeit, Direkt- oder Nachfärbung bereits getrockneter, unzureichend gefärbter Coomassie-Blots

hochselektive Bindungsfähigkeit der Antikörper direkt an unspezifischen, kristallinen Fc-Teil des AK

gekoppelte Reportereinheit

pros:
schnell
keine Kreuzreaktion durch sekundäre AK

contras:
teuer (markierter AK für jedes Protein)
geringe Amplifikation des Signals
Markierung des AKs kann Immunreaktivität reduzieren

pros:
Amplifikation des Signals durch sekundären AK
Vielfalt markierter sekundärer AK erhältlich
Markierung des sekundären AK beeinflusst Immunreaktivität des primären AK nicht

contras:
aufwendiger/zeitintensiver
unspezifische Bindung des sekundären AK möglich

polyklonal: günstiger und leichter zu produzieren

monoklonal: Reinheit und Spezifität sorgen für wenig Hintergrund

Wahl abhängig von Tierspezies, in der der AK generiert wurde

gekoppelt mit Reportern
Enzyme (alkalische Phosphatase (AP) oder Peroxidase (HRP)), radioaktive Markierung oder Fluorophore

Verwendung von Isotopen, meist β-Strahler (32P- und 35S-Isotope), vorzugsweise kurzlebig

durch radioaktive Markierung der AK keine Substrate benötigt

Nachweis durch:
Autoradiographie mittels Röntgenfilm etc.
Fluorographie (Überschichtung der radioaktiven Banden mit fluoreszierenden Chemikalien, Fluoreszenzlichtemission)

kolorimetrisch

Chemilumineszenz

Fluoreszenz

Gold, Silber

Inkubation mit einem Substrat

Substrat reagiert mit Reporterenzym am AK

Reaktion wandelt lösliche Form des Substrates in unlöslichen Farbstoff um, der auf Membran präzipitiert

Proteinlevel werden z.B. durch Densitometrie (Intensität der Färbung) bestimmt

Inkubation mit Substrat, das leuchtet wenn von Reporter umgesetzt

Peroxidase: Luminol als Substrat durch H₂O₂ oxidiert
entsteht 3-Aminophtalat im Anregungszustand, das beim Zurückfallen auf Grundzustand Licht emittiert

Nachweis der Lichtreaktion durch:
Röntgenfilm
CCD (charged coupled device) Kamera
Densitometrie

zählt zu sensitivsten Detektionsmethoden für Blotting-Untersuchungen

mit Fluoreszenz-Farbstoffen gekoppelte AK

Anregung des Fluorophors mit Licht, Emissionslicht wird detektiert

Nachweis des Emission mittels Imaging System, z.B. CCD Kamera

Methode, um spezifisches Genprodukt aus Zelle zu entfernen -> zelluläre Genfunktion untersuchen

kurze ca. 20bp lange dsRNA in der Zelle eingeschleust (siRNA)
-> Genexpression bestimmter Gene mithilfe endogener siRNAs (miRNAs) regulieren

pros:
schnell, kostengünstig

contras:
ungewollte Effekte auf andere Gene (Sequenzähnlichkeiten)

membrangängige kleine Moleküle, die spezifisch an ein Zielprotein binden und so seine Aktivität hemmen
-> akuter Funktionsverlust

pros:
Effekt häufig reversibel, Zielprotein "ab-und anschaltbar"

contras:
wirken nicht völlig spezifisch (viele Proteine haben strukturell ähnliche aktive Zentren)

Proteine bleiben nativ

weitere Nutzung möglich

native Proteinkonformation kann untersucht werden

Analyse von Modifikationen, kleinen Änderungen (Phosphorylierung, Disulfidbrücken)

für jedes Protein optimaler Puffer (pH-Wert)

Analyse von Proteinkomplexen aufgrund ihrer Größe und Zusammensetzung sehr schwierig

Proteingemische, wie z.B. Zellaufschluss können nicht analysiert werden

sehr langsame Auftrennung nötig (Proteinstabilität)

Coomassie Blue R-250

bindet im sauren Milieu an Proteine

Hintergrundfärbung durch Essigsäure herausgewaschen

Nachweisgrenze bei 100 ng

beruht auf Komplexbildung von Ag⁺-Ionen mit Glutamin-, Asparagin- und Cysteinresten von Proteinen

Detektion durch Agenzien, welche Ag⁺-Ionen zu metallischem Silber reduzieren

Nachweisgrenze bei ≤10 ng

1. Fixierung: Formalin, Glutaraldehyd

2. Einbettung: aufsteigende Alkoholreihe -> Paraffin/Kunstharz/Gelatine/Kryomedien

3. Schneiden: Schlitten-/Rotations-/Kryo-/Ultramikrotom

Schlitten/Rotation: ca. 1-60 μm, Paraffin

Kryo: 5-100 μm, Kryo-/Gefriermedien

Ultra: ca. 0,01-0,5 μm, Kunstharz

langkettige Kohlenwasserstoffe (Wachs)

Schnitte ca. 5-8 μm dick

pros:
gute Durchdringung des Gewebes

contras:
Entwässerung des Gewebes
nur in organischen Lösungsmitteln löslich (für Färbung muss Wasser wieder zugefügt werden)

sehr dünne Schnitte

ca. 1-2 μm

pros:
gut geeignet für harte Gewebe

contras:
Entwässerung des Gewebes und Spezialmesser notwendig
nur für wenige Färbemethoden verwendbar

wasserlöslich

gute und schnelle Durchdringung des Gewebes

Kultivierung des Gewebeschnittes möglich

pros:
gut für weiche Gewebe geeignet

contras:
eher dicke Schnitte
ca. 10-20 μm

frische Organstücke werden in flüssigen Stickstoff eingebracht
Einbettung in Sucrose-haltige Lösungen zur Stabilisierung

schnelle Methode, v.a. für medizinische Diagnostik

pros:
native Proteine
kein Wasserentzug
gut für Immunhistochemie geeignet

contras:
nicht for harte Gewebe geeignet
schlechtere Morphologie der Gewebe
stärkere Artefaktbildung

4% neutrale Formaldehydlösung, HCHO
Aldehyd der Ameisensäure

bei Benutzung wird Formalin verbraucht, es entsteht Ameisensäure

langkettiges Polymer wird Paraformaldehyd genannt

contras:
Fixierung von Proteinen, nicht von Kohlenhydraten oder Lipiden

Wasserentzug bewirkt Fällung der Proteine ohne Denaturierung

permeabilisiert Membranen

contras:
Härtung und Schrumpfung des Gewebes

1. MZB Probe

2. Homogenisieren

3. DNA-Extraktion
DNA-Amplifikation

4. DNA-Sequenzierung

1. computer-aided design of staples

2. sample preparation

3. self assembly

4. purification

5. ensemble and single-particle analysis

6. single-molecule force measurements

Gelelektrophorese

atomic force microscopy

transmission electron microscopy

Produktion langer ssDNA aus Bakterien
chemische und biochemische DNA-Protein-Konjugation
Agarose-/Polyacrylamidgelelektrophorese
PCR
DNA-Sequenzierung
Fluoreszenzspektroskopie (FRED)
Ionenaustauschchromatografie
Rasterkraftmikroskopie (AFM)
Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
Einzelmolekül-Kraftmessung

Manipulation und Visualisierung von Molekülen mithilfe einer scharfen Spitze auf einer freitragenden Feder

einzelne Atome sehen und manipulieren

verwenden Licht in Form eines starken fokussierten Lasers um Objekte in Nanogröße einzufangen

jede Verschiebung aus Laserfokus durch elektromagnetische Rückstellkraft kompensiert, die Teilchen wieder in ursprüngliche Gleichgewichtsposition zurückbringt

Kraft (pN) oder Entfernung (nm) kann genau gemessen werden

einzelne Moleküle sichtbar machen und manipulieren

membrangängig aber gleichzeitig wasserlöslich

spezifisch für ein Zielprotein (Target), keine Off-Target Effekte

in geringen Konzentrationen aktiv

Modifikation permanent
Wirkung chronisch (meist)
Zelladaption wahrscheinlich
nicht reversibel
keine Off-Target Effekte

pros:
genau definierte, reproduzierbare Situation
Gene Editing erlaubt Routinebenutzung

contras:
ohne Gene Editing sehr aufwendig
hohe Adaptionswahrscheinlichkeit

Modifikation transient/permanent
Wirkung akut (Tage)/chronisch
Zelladaption unwahrscheinlich/wahrscheinlich
nicht reversibel
Off-Target Effekte wahrscheinlich

pros:
theoretisch jedes Gen kostengünstig untersuchbar

contras:
hohe Wahrscheinlichkeit von Off-Target Effekten

Modifikation transient
Wirkung sehr akut (Minuten)
Zelladaption unwahrscheinlich
oft reversibel
Off-Target Effekte wahrscheinlich

pros:
sehr einfache kostengünstige Benutzung
meist reversibel

contras:
Entwicklung extrem teuer und aufwendig
hohe Wahrscheinlichkeit von Off-Target Effekten

Chemotherapie

verhindert Depolymerisation

hyperstabilisiert Mikrotubuli

verhindert Polymerisation

destabilisiert Mikrotubuli