Take Home Messages

Homogenisieren

•Mischen

•Ultraschallbad

•Zerkleinern

•Mahlen

•Mörsern

•Sieben

Flüssig-Flüssig-Extraktion

-LLE (liquid liquid extraction)

-Beispiel: Extraktion von Konservierungsstoffen aus Salatsauce

-Verteilung von Stoffen zwischen nicht miteinander mischbaren Phasen (hydrophil und hydrophob)

Stir bar sorptiveextraction (SBSE)

- Beispiel: Extraktion von PAK aus Wasser; Trennung mittels HPTLC

- 20 mLWasserprobe mit belegtem Rührfisch 2 h rühren lassen

Festphasenextraktion (solid phase extraction)

→ Anreicherung und Isolierung

Festphasenmikroextraktion

- Solid phasemicro extraction: SPME

High throughput planar SPE (HTpSPE)

- Simultane PV zum Nachweis von Pestiziden auf einer DC-Platte

QuEChERS

•PV zum Nachweis von Pestiziden

•Schnelle Aufarbeitungsmethode (~15 min/Probe)

Zentrifugieren

•Zentrifugalkraft trennt Bestandteile unterschiedlicher Dichte

•schwerere Teilchen sammeln sich am Gefäßboden

Filtration

Destillation

- Kondensation und Auffangen im Sammelkolben

- Probe wird mehr; SBSE, SPE

- Probenvolumen (ges)/ Anreicherungsfaktor = untersuchtes Volumen

- Ziffern, die etwas über den Messwert und dessen Präzision sagen, nennt man signifikant.

- das Produkt unterliegt natürlichen Schwankungen (Z.B. klimatische Bedingungen)

- Abbaugeschwindigkeiten

- hohe analytische Variabilität

- höhere Stabilitätszuschläge als 50% notwendig für z. B. Vitamin C, Folsäure, Pantothensäure und Vitamin B12 in Getränken, um mittleren Gehalt bis Ende der angegebenen Haltbarkeit zu gewährleisten

Chromatographie: Multiplikative Verteilung der Analyten zwischen zwei nicht mischbaren Phasen in kontinuierlicher, dynamischer Arbeitsweise.

Adsorptionschromatografie:

- Analyt wird an dem Adsorbens (Stationäre Phase, SP - fest) kurzzeitig adsorbiert, bei flüchtigen Stoffen/kleinen Molekülen

- Stärke der Wechselwirkung bestimmt Ausmaß der Verzögerung (Retention)

Verteilungschromatografie:

- SP ist flüssig, aber an ein festes Trägermaterial gebunden, somit unbeweglich

- Trennung erfolgt durch multiple Verteilung

-> Analyt ist unterschiedlich gut in stationärer und mobiler Phase löslich

-> je besser sich ein Analyt in der SP löst, desto länger hält er sich darin auf und desto weniger weit wird die MP ihn transportieren

->  Umgekehrt wird ein Analyt, der besser in der MP löslich ist, eine größere Strecke transportiert

 Einteilung nach Zustand der mobilen Phase:

-flüssig: Flüssig(keits)-Chromatographie (LC); Hochleistungs-Dünnschicht-Chromatographie (HPTLC); Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC)

-superkritisch: Überkritische Fluid-Chromatographie (SFC)

-gasförmig: Gaschromatographie (GC)

Einteilung nach Geometrie der stationären Phase:

-Säule: Säulen-Chromatographie (SC); Gaschromatographie (GC); Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC); Überkritische Fluid-Chromatographie (SFC)

-Planares Medium: Planar-Chromatographie; Hochleistungs-Dünnschicht-Chromatographie (HPTLC); Dünnschicht-Chromatographie (DC)

- Beschreibt die Trennleistung in der Gas – und Flüssigchromatografie

A=Konstante, Eddy-Diffusion

B=Strömungsprofil (Peakverbreiterung)

C= Gleichgewichtseinstellung (wie schnell?)

1. Peakbreite auf halber Peakhöhe

2. Peakbreite an der Peakbasis

Umkehrphasensystem: Kettenlänge und Lipophilie

Normalphasensystem: Funktionelle Gruppen und Polarität

Komplexbildung: Anzahl an Doppelbindungen

Van der Waals Kräfte

Dipol-induzierter Dipol

Dipol-Dipol

Wasserstoff-Brückenbindung

Ionische Kräfte

Kationenaustauscher: Sulfonsäure(starker) oder Carboxylgruppe (schwacher) als Anion und Na+ als Gegenion

Anionenaustauscher: Quart. Amin (starker) oder Diethylaminoethyl (schwacher) als Kation und Cl-als Gegenion

- Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography

- Sulfobetain-Struktur bleibt Zwitter über großen pH-Bereich

- Größenausschluss

SEC Size exclusion chromatography (Überbegriff)

GFC Gelfiltrations-Chromatographie (wässrige MP)

GPC Gelpermeations-Chromatographie (organische MP)

Besser, da technisiert.

Probenvorbereitung(+Schichtreinigung) -> Auftragen (+Vorkonditionierung der Schicht) -> Entwicklung (+postchromatografische Derivatisierung) -> Auswertung (+UV/VIS – und Floureszensdetektion, Spektrenaufnahme) -> Dokumentation

- HPTLC kann mehrere Proben gleichzeitig bearbeiten

- leichteres Auftragen

HPTLC: 3 Phasen (stationäre, mobile und Dampfphase)

HPLC: 2 Phasen (fest und flüssig)

Auftragen:

Aufspühen (Bei der Sprühauftragung hat das Auftrage-Lösungsmittel keinen großen Einfluss! Bandförmiges Aufsprühen verbessert zudem die Auftrennung!)

Kontaktauftragung (Das Auftrage Lösungsmittel hat einen großen Einfluss bei der Kontaktauftragung=

Entwicklung:

Flachbodenkammer, Doppeltrogkammer (TTC), Horizontalentwicklungskammer (HDC), Automatische Entwicklungskammer (ADC2), Automatische Mehrfachentwicklung (AMD2)

Absorptionsmessung → indirektes Signal

Fluoreszenzmessung → direktes Signal, zusätzlich Filter

Nach Messung → Peak-Koordinate → Spektrum

unpolare

Prächromatographisch: Automatisches Sprühen

Postchromatographisch: Tauchen, manuelles/automatisches Besprühen, Bedampfen, Bedrucken, Bestrahlen

Beispiele für Universal-Reagenzien: Aldehyd/Säure-Reaktionen und Molybdato-Phosphorsäure

Gruppenspezifische Reagenzien: Ninhydrin (für Aminosäuren), Diphenylamin/Anilin-Reagenz (DPA), ß-Naphthol-Reagenz, Aminogruppe der stationären Phase, Diazotierungsreaktionen, Hydrazon-Bildung, Dansylierung

Selektive Derivatisierungsreagenzien: zeigen bestimmte chemische Elemente an

MS (Massenspektrometer)

Office Chromatography (All-in-one-System)

Verteilung

Doppelkolbenpumpen zur pulsationsfreien Förderung

Rubinkugel und Saphirkolben

Spülen der Anlage

Hochreines Kieselgel

Schutz der Hauptsäule

•Lösungsmittel v. a. mit Wasser mischbar (Umkehrphasensystem)

•geringe Viskosität

•gute UV-Durchlässigkeit

•Reinheit

•Brechungsindex

•Siedepunkt

•Toxizität

- Permeations-Vakuumsentgaser

- Wärme, Ultraschall, Inertgas

- > Gasblasen stören den gleichmäßigen Fluss des Eluenten und verstärken das Rauschen im Detektor oder erzeugen sogenannte Geisterpeaks

- Messung der Lichtabsorbanz im UV/VIS-Bereich (Photometrie)

-> Absorption

- Lichtabsorbanz proportional der Schichtdicke der Küvette, hier Durchflusszelle

-> Diskriminierung zweier rasch aufeinanderfolgender Analyten erfordert geringes Volumen der Zelle

-mit Prisma, zeigt alle Wellenlängen

-> für nativ fluoreszierende Substanzen, z. B. Chinin, PAKs, etc. oder nach Derivatisierungmit einem Fluorophor, z. B. Dansylierung

• direkte Messung des Signals!

• Filter zur Monochromatisierung der Anregungs- und Emissionswellenlänge

- Verdampfungs-Lichtstreu-Detektor

→ zur Detektion von Substanzen mit signifikant höheren Siedepunktals MP (leichtflüchtige Puffer!)

- Eluent wird verdampft (Laufmittel wird nicht detektiert, kann also optimal auf die Trenneigenschaften hin ausgewählt werden)

- Es können nur ionisierbare Verbindungen bzw. Ionen nachgewiesen werden

Ionenerzeuger •Analyt wird ionisiert; Wahl der Ionenquelle hängt von den zu analysierenden Substanzen ab

Massenselektor/Analysator •Ionen werden nach ihren Massen separiert z.Bdurch elektromagnetisches Feld

Detektor •Erfassung der zuvor separierten Ionen

Umfasst alle chromatographischen Methoden, bei denen die mobile Phase ein Gas ist. Da Stofftransport im gasförmigen Zustand, für alle Stoffe mit folgenden Eigenschaften

-gasförmig

- unzersetzt verdampfbar

- durch Derivatisierung in flüchtige Stoffe überführbar

- einer kontrollierten Spaltung unterwerfbar

- Trennung durch unterschiedliche Verteilung (Isothermen) der Analyten zwischen stationärer und mobiler Phase (Wechselwirkungen und Dampfdruck)

Wechselwirkungen: Orientierungskräfte, Induktionskräfte, Dispersionskräfte, spezifische Wechselwirkungen

Clausius-Clapeyron: Temperaturänderung um 30°C ergibt Verdoppelung des Dampfdruckes und damit Halbierung der Retentionszeit

- Verbindungen werden durch Retentionsindices charakterisiert

- Der Retentionsindex einer Substanz ist gleich 100 x der Kohlenstoffzahl eines hypothetischen n-Paraffins mit der gleichen reduzierten Retentionszeit wie die interessierende Substanz

- Je größer K, desto größer ist die Selektivität einer SP ggü. eines Analyten

- „Gleiches löst sich in Gleichem“

> K für apolare Substanz in apolarer SP

> K für polare Substanz in polarer SP

Apolare SP: Squalen-Phasen

Unpolar – polar: Polysiloxan-Phasen

Polare Gruppen in der SP: -CN, -CO, -COC, -OH (Polyethylenglycol-Phasen)

- Nur 1 Flusspfad

- Dünner, gleichmäßiger Film an der Säuleninnenwand

- Polyimidbeschichtung (außen nach innen)

- Fused silica-Träger

- Belegung mit SP

- Nein, da jeder Stoff ein anderes Expansionsvolumen besitzt

- Glasröhre, in die die Probe injiziert wird und diese dann verdampft wird

Wasser am Größen; Hexan am Kleinsten

-  aufgehängte Trennsäule wird nach definiertem Temperaturprogramm geheizt

- Temperaturbereich ca. 10 °C über RT bis ca. 500 °C +- 0,1-0,2 °C

- Temperaturprogrammierung: Anfangstemperatur –isotherme Zeit –Heizrate bis Endtemperatur –isotherme Zeit .... –Equilibrierzeit

- Heizrate je nach Säulendurchmesser Kompromiss zwischen Schnelligkeit und Selektivität (geringe T → gute Auflösung Rs; hohe T → schnelle Analyse) für Proben mit stark unterschiedlichen Siedepunkten

Ferrules:

Wird das falsche Ferrule gewählt, können schon nach wenigen Temperaturzyklen z. B. Undichtigkeiten auftreten

              Hartes Material (z.B. Vespel, Graphit, Metall)

Septen:

- Teflon-beschichtetes Silikon

- dreilagiges Silikon, Teflon-beschichtet

- weiches Silicon für große Injektionsvolumina und manuelle Injektion

- minimales Septumbluten (HTGC)

- Silylierungsreaktionen

- Acylierungsreaktionen

- Alkylierungsreaktionen

-Kondensationsreaktionen

Universell: FID, PID (Photoionization detector)

Zerstörungsfrei: WLD

ECD= Electron capture detector/Elektroneneinfangdetektor (konzentrationsabhängiger Detektor) ->  radioaktiv, genehmigungspflichtig, misst Substanzen mit elektronegativen Substituenten  aufgrund des Ioneneinfang-Effektes (Herabsetzung des kontinuierlich fließenden Grundstromes)

- für mehrfach halogenierte Substanzen

WLD/TCD= Wärmeleitfähigkeitsdetektor/Thermal conductivity detector (konzentrationsabhängiger Detektor) ->

misst den Unterschied zwischen der thermischen Leitfähigkeit des reinen Trägergases und derjenigen des Trägergases mit eluierten Komponenten, d.h. spricht auf Substanzen mit unterschiedlicher Wärmeabgabefähigkeit als das Trägergas an

FID= Flammenionisationsdetektor (mengenabgängiger Detektor)-> misst die Ionen, die bei einer Verbrennung von org. Substanzen in einer Wasserstoff/Luft-Flamme entstehen (→Leitfähigkeit in einem elektrischen Feld)

- wenn die voher gerade Basislinie nach oben ansteigt

• probenfremde Komponente, dem Analyten chemisch ähnlich, aber nicht identisch

• Elution in der Nähe des Analyten, an freier Stelle im Chromatogramm

• ähnliches Ansprechverhalten, ähnliche Peakgröße

• Stabilität im chromatographischen System

- Mehrpunkt-Kalibration: „Linearität“ (analyticalresponse) eines analytischen Verfahrens, 5 Punkte,

- Einstandard-Kalibration: wenn Sollwert bekannt (z. B. Tablettenwirkstoff)

Bestimmung eines Verhaltens über den gesicherten Bereich hinaus. Nicht erlaubt!

- Kalibrierlösungen unabhängig aus einer Stammlösung herstellen

• Regressionsmodelle: linear, polynom, Michaelis-Mentenetc.

• Güte der Funktion: Bestimmtheitsmass, Standardabweichung der Kalibrierfunktion

• 5-Punkte-Kalibration und äquidistante Konzentrationsintervalle

• Arbeitsbereich um zu erwartende Probekonzentration legen (Probenwert sollte im mittleren Kalibrierbereich liegen)

• Quantifizierung nur im abgesicherten Bereich (zulässige Abweichung 0 %)

• Niedrigster Kalibrierpunkt: ab Bestimmungsgrenze

• Arbeitsbereich absichern: Varianzen-F-Test (Varianzenhomogenität)

Wenn Soll-Wert bekannt

Datensätze müssen prinzipiell ausreisserfrei und normalverteilt sein!

Mittelwert: wenn normalverteilt

Modalwert (Gipfelwert): häufigste/vorherrschende Wert einer Datenreihe; Mehrgipfelige Verteilungen haben mehrere „lokale“ Modalwerte: Bimodale Verteilung bei 2 Modalwerten

Median: Wertereihe wird nach Größe geordnet, halbiert; bei U- und J-förmigen, aber auch z.T. bei eingipfeligen schiefen Verteilungen

1. Verfahren zur Eliminierung systematischer Fehler

–Verwendung eines internen Standards (Kriterien)

–Vergleichsprobe, Wiederfindungsrate (Kriterien)

–Blindprobe (Hinweis auf Matrixinterferenzen)

–Standardaddition/Aufstockung

–Verwendung eines Referenzverfahrens, 2. unabhängiges Verfahren

2. Anwendung des Verfahrens auf ein Referenzmaterial

3. Teilnahme an Ringversuchen

–Qualifikationsnachweis, Einordnung ggü. Konkurrenz

–Bias und Präzision im Vergleich

Wenn keine Blindmatrix vorhanden ist, mit der man die Wiederfindungsrate ermitteln

konstant systematischer Fehler

proportional systematischer Fehler

Varianzen-F-Test (Test auf Varianzenhomogenität)

Mittelwert-t-Test: Test auf Mittelwertsunterschiede zweier Stichprobenreihen

• Mittelwert-t-Test und Varianzen-F-Test: weisen beide Tests keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich Mittelwert und Varianzen auf, können die 2 Messreihen zusammengefasst werden

Vorteil: n ist größer -> VB wird enger -> Ergebnis wird sicherer

Good Laboratory Practise

- Gesundheitsschutz, Sicherheitsmaßnahmen, Aus-, Fort-, Weiterbildung, Benutzer-”Validierung” (Benutzer-Passwort, Berechtigungsebenen), Prüfpläne, Standardarbeitsanweisungen (SOP), Referenzsubstanzen, Datensicherung/Archivierung

- Spezifität, Selektivität, Linearität bzw funktioneller Zusammenhang zwischen Messwert und Konzentration, Empfindlichkeit, Arbeitsbereich, Bestimmungsgrenze, Richtigkeit, Präzision, Robustheit, Regelkarten

- letzten beiden könnte man weglassen

- Arbeitsbereich absichern: ab Bestimmungsgrenze, Varianzen-F-Test (Test auf Varianzenhomogenität)

- Konzentration, ab der eine Substanz quantitativ erfasst und statistisch signifikant (deutlich) von Null (Blindwert, Leerwert) unterschieden werden kann

= 2-3 fache Nachweisgrenze (limitof detection, LOD)-> Konzentration, ab der eine Substanz detektierbar ist

Bestimmungsgrenze (BG, limitof quantification, LOQ)= 3-fache Nachweisgrenze

- Kalibrierfunktion

Nachweisgrenze (NG, limitof detection, LOD)= 3-fache Rauschen

Bestimmungsgrenze (BG, limitof quantification, LOQ)= 3-fache Nachweisgrenze

Richtigkeit: wahren Wert in der Analyse bestimmen

Präzision: Schwankung der Analysenwerte eines Analyten (Mehrfachmessung)

Genauigkeit = Richtigkeit+ Präzision

zufällige Fehler → in beide Richtungen gehend (nicht repräsentativ, nicht ausreichend, nicht reproduzierbar, Gerätefehler, Volumen-Wägefehler)

systematische Fehler → immer in gleiche Richtung gehend (immer durch Erwärmung Analytverlust, falsch gewählte zB Basislinie, falsch gehende Waage)

Nalimov: schärfste -> nur für kleine Datenmengen

Grubbs: mittel

Dixon und Dean: mildeste

-> Schwierigkeiten, wenn zwei Ausreißer ähnlich sind

Standard operating procedere

Dokumentiert Benutzer eines Gerätes, Geräte-prüfungen, Gerätenutzung ist nachvollziehbar

- Mittelwert-, Wiederfindungs-Regelkarten etc. zur inneren QS

- „Mitlaufenlassen“ einer Kontrollprobe; Indiz auf Richtigkeit des Verfahrens

SOP, IQ, OQ, PQ, MQ, Logbuch, 21CFR-part11

- ein Experiment, bei dem mehreren Laboratorien ein identisches Material auf die gleiche Messgröße hin untersuchen und die Resultate vergleichend beurteilen

- Ringversuche

- Nachweis aller einzelnen Schritte samt Operationen und Bedingungen, der lückenlos und nachvollziehbar belegt, wie das Ergebnis zustande kam!

- alle Zahlen ohne die 0