Zurück

Schwerpunktsetzung 4 VO Elmer prüfungsrelevant

18 Karten
4 Lernende
Theres Fersterer
Theres Fersterer vor 2 Jahren

18 Karten

Phasen der Interphase

G0 --> keine Zellteilung, keinWachstum

G1 --> Wachstumsphase, hohe Proteinsynthese

S --> DNA-Replikation

G2 --> Kontrolle der DNA-Replikation

Von was wird Zellproliferation kontrolliert?

  • intrazelluläre Signalnetzwerke
  • gefördert durch Mitogene, Cytokine, anti-apoptotische Faktoren
  • inhibiert durch cytostatische Faktoren, pro-apoptotische Faktoren

Anzeichen Apopotose

  1. Pyknose: Zellen werden klein und rund
  2. Nukleus fragmentiert 
  3. Membran in früher Apoptose intakt
  4. Membran erfährt "blebbing" in späterer Apoptose
  5. Zellinhalt wird von Apoptotischen Körpern phagocytiert
  6. nur apoptotische Zellen davon betroffen
  7. ATP-Verbrauch
  8. keine Entzündung
  9. Caspasen aktiv

Anzeichen Nekrose

  1. Onkose: Zelle schwillt an während Nekrose
  2. Zellkern intakt
  3. Membran wird durchlöchert
  4. Zellinhalt fließt aus
  5. benachbarte Zellen betroffen
  6. Entzündung

Beschreibe den 'LDH leakage assay' zur Analyse der Membran Integrität!

'LDH' = Lactat-Dehydrogenase

 

LDH kann nur durch durchlöcherte Membranen in die Zelle. Im Cytoplasma katalysiert die LDH Lactat zu Pyruvat und reduziert NAD+ zu NADH. 

 

Durch NADH wandelt dann Tetrazolium zum Farbstoff Formazan um (der bei 492nm absorbiert), dass gemessen wird. 

 

Die Menge an Formazan ist proportional zur Menge an LDH in den Zellen, ist proportional zur Anzahl an geschädigten Zellen.

Was ist PI und was färbt es?

PI = Propium Iodid 

 

Färbt DNA rot und kann nur durch die durchlöcherte Membran nekroser Zellen

Was ist 7AAD und was macht es?

7AAD = 7-Aminoactinomycin

 

Färbt DNA rot und kann nur durch die durchlöcherte Membran nekroser Zellen

Wie färbt Trypan Blue?

Färbt Zellinhalt blau und kann nur durch die durchlöcherte Membran nekroser Zellen

Wie färbt Flourescin-Diacetat (FDA)?

Diffundiert durch die intakte Zellmembran und färbt den Zellinhalt von lebenden Zellen grün.

 

FDA diffundiert durch die Membran und wird im Inneren von Esterasen in Flourescin und Diacetat gespalten. Das Flourescin kann alleine nicht mehr aus den Zellen hinausdiffundieren. Zudem flouresziert es grün.

Beschreibe das Zell Viability Stain mit PI und Flourescin-Diacetat (FDA)!

In intakten Zellen flouresziert das Flourescin grün und bleibt drin.

 

In Zellen mit durchlöcherten Membranen fließt das FLourescin raus und das PI kann die Nukleinsäuren im Inneren färben.

 

--> grün: lebend

-->rot: Nekrose

Wie färbt der Farbstoff Hoechst?

Hoechst kann Zellmembranen durchqueren und flouresziert bei Bindung an Nukleinsäuren blau.

--> Färbung von DNA/RNA von lebenden und toten Zellen

Wie färbt Calcein-Acetoxymethylester (Calcein-AM)?

Calcein-AM kann Membranen durchqueren, um dann im Inneren von Esterasen gespalten zu werden. DIe beiden einzelen Stoffe können dann die Zelle nicht mehr verlassen. 

 

Freies Calcein bindet an Strukturen im Zellinneren und flouresziert grün.

Beschreibe den Membrane Integrity Assay mit Calcein-AM und Hoechst!

Calcein-AM --> Membran intakt?

 

Hoechst --> DNA intakt?

Wie funktioniert die Detektion von apoptotischen Zellen durch Phosphatidylserinen (PE)?

Phosphatidylserine sind Membranproteine, die normalerweise auf der cytosolischen Seite der Plasmamembran sitzen. Im Laufe der Apoptose wird die Zellmembran durch die Caspase-Aktivität umgedreht. Die Phosphoserine sitzen nun außen. Mithilfe des Reporters Annexin V (5) lassen sich diese detektieren.

Wie kann man den Assay zur Detektion von Zellenmithilfe von Annexin V und PI ablesen?

Annexin 5: positiv

PI: positiv

 

--> späte Apoptose oder Nekrose

 

 

Annexin 5: negativ

PI: negativ

--> lebende Zellen

 

 

Annexin5: positiv

PI: negativ

--> frühe Apoptose

Beschreibe den 'PARP Cleavage Assay'!

PARP = Poly-ADP-Ribulose-Polymerase

 

PARPs sind Enzyme, die ssDNA-Brüche reparieren. Während der Apoptose werden PARPS durch die Caspasen 3 und 7 deaktiviert. 

Können mittels spezifischen Antikörpern detektiert werden.

 

Keine PARPS --> Apoptose

Beschreibe den Morphologischen Assay mit Hoechst und PI!

 

(Hoechst --> blau, kann durch Membranen diffundieren

PI --> rot, kann nicht durch Membranen diffundieren;

beide färben DNA)

ganzer Nukleus, blau --> lebende Zelle

 

fragmentierter Nukleus, blau --> frühe Apoptose

 

ganzer Nukleus, pink --> Nekrose

 

fragmentierter Nukleus, pink --> späte Apoptose

Beschreibe Cell Cycle Assays mit Cdt1 und Geminin und FUCCI!

FUCCI = Reporter

--> bindet in verschiedenen Phasen des Zellzyklus an verschiedene Replikationsfaktoren (Cdt1 und Geminin) und floureszieren dan unterschiedlich

 

G1 --> Cdt1 --> grün

S/G2/M --> Geminin --> rot

Jetzt lernen