Genetik 6+7 (Genomanalyse und Rekombinante DNA-Technologie, DNA-Sequenzierung)

sind meist Prokaryotische Enzyme, welche Palindrome Sequenzen schneiden.

RE können blunt (gerade) oder sticky (klebrige) Enden Erzeugen. Nur sticky Ends mit gleichen Überhängen können wieder verknüpft werden.

-> werden in Mikrobiologie verwendet um DNA-Sequenzen in weiterverwertbare Sequenzen zu zerschneiden

Fremde DNA kann in bakterielle Plasmide eingebracht, und dort vermehrt werden.

High copy number origin of replication.

Durch die Ampizillin Resistenz Kasette (beta lactamase) können jene Bakterien auf Ampizillin Platten wachsen, welche ein Plasmid erhalten haben.

=> Nur Bakterien mit Ampizillin Resistenzgen wachsen auf Ampizillin Platten

bromo-chloro-indolyl-galactopyranoside wird durch beta Galactosidase in galactose and 5-bromo-4-chloro-3- hydroxyindole gespalten, welches an Luft dimerisiert und so eine blaue Färbung verursacht

5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-galactosid ist eine farblose Indikatorsubstanz

z.B. Hefezellen, in denen das lacZ-Gen aus E. coli als Reportergen aktiviert wird, anhand der blauen Färbung identifiziert werden.

Yeast artificial Chromosom, erlauben das klonieren von bis zu 2MB an DNA

Bacterial artificial chromosom, artifizielle Chromosomen erlauben das Klonieren großer Fragmente (300kb).

Gelelektrophorese von DNA erlaubt deren Auftrennung nach Grösse im elektrischen Feld

Genomische DNA wird mit Restriktionsenzymen partiell verdaut und in einen Vektor (Plasmid, Bakteriophage Lambda, Cosmid) kloniert. Um sicher zu gehen, dass kein Fragment fehlt, müssen alle Fragmente mehrmals vorhanden sein.

Theoretisch: unendlich viele

Praktisch:

N=ln(1-P) / ln (1-f) P= Wahrscheinlichkeit das alle Fragmente vorhanden sind f= Insertgrösse/Genomgrösse

zB. 1.3 Mio Klone von 10kB decken das menschliche Genom zu 99% Wahrscheinlichkeit ab. Oder 56.000 YAC Klone zu 260kB decken das menschliche Genom zu 99% ab.

Sanger 1977

1. H-Brücken zw. Basen durch Hitze aufschmelzen

2. Einzelstränge entstehen, Primer werden auf Stränge gesetzt die ein Teil des Stranges erkennen und DNA-Synthese vollziehen

3. Einbau von didesoxy-Nucleotid (ddntp) führt zum abbruch der Synthese

-> es entstehen mehrere Stücke des DNA Stranges

4. verschiedene ddNTP sind mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert (z.B. ddG = Grün, ddA = gelb, ...)

5. Abtasten der Signale mit einem Laser, erlaubt die Sequenzbestimmung.

 misst Biochemische Reaktion des Einbaus

Pyrosequencing

Illumina sequencing

Nachteil: Kurze Sequenzen, teuer pro Lauf

Vorteil: Millionen an Sequenzen gleichzeitig, billig pro Base

1. DNa mobilisiert man auf einen Träger (bead)

2. Primer wird gesetzt und erkennt die Sequenz

3. Der Reaktion wurden abwechselnd Gemische  (dCTP, dGTP, dTTP, dATP) hinzugefügt.

4. Durch Einbau wird Pyrophosphat frei, PPi wird zu ATP und porduziert Licht (Lichtblitz messbar)

(siehe Bild)

Zwischen 2007 und 2012: Sequenzierkosten um 1000-faches gesunken

1.      Library Preperation: DNa wird fragmentiert & adapter an Enden drangehängt

2.      Cluster Generation: Die Fragmente werden über den Adapter auf einem Objektträger gebunden

3.      Hybridize Fragment & Extend: Primer synthetisieren Doppelstrang

→ diesen erhitzt man & so fällt der originale Strangweg und es bleibt der neu synthetisierte Strang über

→hat nun einen Einzelstrang, der an den Träger gebunden ist

4.      Bridge Amplification: Die DNA-Fragmente “beugen“ sich mit ihrem freien Adapter zu einem der unbesetzten Primer hin. →Eine Polymerase beginnt nun ab diesem Primer den komplementären Strang zu synthetisieren

5.      Denatur Double-Stranded Bridge: Durch Denaturierung werden die Stränge wieder getrennt -> Forward- & ein Revers-Strang. Amplifizierung wird mehrfach durchgeführt.

6.      Linearization: Es entstehen überall auf dem Objektträger unterscheidbare Cluster, die jeweils die identische Sequenz besitzen.

7.      Reverse Strand Cleavage: Bei diesem Vorgang werden die Reverse-Stränge weggewaschen à es bleiben die Forward-Stränge übrig

8.      Blocking: Blockiert das Ende der DNA-Stränge

9.      Read 1 primer Hybridization: kann an das bekannte Ende einen Primer hybridisieren

10.  Sequenzing by Synthesis: Es werden nun ein Primer, die Polymerase & die gelabelte dNTPs zugegeben.

- Nach dem Einbau eines Nukleotides stoppt die Synthese

- Ein Laser regt die fluoreszenten Labels an

- Überall auf der Platte leuchtet jeweils das im Cluster eingebaute Nukleotid auf.

- Die Kamera speichert das Bild

- Jeder der einzelnen Cluster wird von der Software registriert

- Ein Enzym spaltet nun das Label ab & das zweite Nukleotid wird eingebaut

- Dieser Vorgang wird wiederholt, bis das Fragment komplett synthetisiert ist

1) mRNA wird mittels Hybridisierung an oligo dT Säulen gereinigt.

2) Von einem oligo dT Primer wird mittels reverser Transkriptase eine cDNA hergestellt.

3) DNA Pol stellt den zweiten Strang her

4) Die cDNA Fragmente werden mittels Linker in einen Vektor kloniert.

Variationen in Genomen können mit Signale nucleotide polymorphismus (SNPs) identifiziert werden. SNP-maps können mittels Microarrays identifiziert werden. Auf einem Objektträger sind Oligonukleotide, welche das gesamte Genom abdecken aufgebracht. An diese Sequenzen können markierte Sequenze hybridisiert werden. SNP Variationen in einer isolierten Population (zBIsland) können gut zur Identifikation von genetischen Risikofaktoren und Prädispositionen herangezogen werden.

- Vergleichende Genomik: Komplett sequenzierte Genome erlauben die Identifikation homologer Gene mittels Bioinformatik.

- Bioinformatische Vergleiche erlauben die funktionelle Zuordnung vieler Gene.

- Isolation von homologen Genen mittels Komplementation

Vom Gen zum Phän. Erlaubt die Analyse von Gen-Funktionen aufgrund spezifischer Inhibition eines bestimmten Genes

Isolation eines bestimmten Gens mittels Polymerase Chain Reaction (PCR)

Rekombinante Mäuse

RNA Interferenz

Voraussetzung für die erfolgreiche Anwendung der PCR war die Isolierung von thermostabilen DNA-Polymerasen. Diese wurden in Thermophilen Prokaryoten gefunden.

Um rekombinante Mäuse zu generieren, wird das Zielgen in embryonalen Stammzellen (ES) Zellen durch homologe Rekombination zerstört.

Rekombinante ES Zellen werden in Blastozysten injiziert, wo diese zum sich entwickelnden Embryo beitragen. Die Blastozysten werden in scheinschwanger Mäuse injiziert. Ist die Injektion erfolgreich entsteht eine chimäre Maus. Haben die transgenen Zellen zur Keimbahn beigetragen, kann eine heterozygote Maus entstehen, die anschliessend homozygotisiert wird.

Reverse Genetik kann auch mittels RNA-Interferenz (RNAi) durchgeführt werden

Hierbei wird nicht das Chromosom geändert, sondern die transkribierte mRNA eines bestimmten Gens wird aus dem Verkehr gezogen →knock-out Prozess

man kann damit menschliche Genome manipulieren mittels Cas9 (Enzym), das die DNA bricht und neue Stücke einfügen kann →durch guide-RNA weiß es, wo es den Bruch setzen muss

Hierbei handelt es sich um die neueste Methode, um Gene zu manipulieren.