Genetik 3+4 (Genexpression I+II)

Bildung eines von einem Gen kodierten Genprodukts, vor allem von Proteinen oder RNA -Molekülen

Verwendung von Neuraspora (Schimmelpilze) zur Isolation von Mutanten, welche in bestimmten Stoffwechselwegen defekt sind.

Isolation von auxotrophen Mutanten (sind auf zugegebene Aminosäuren angewiesen)

Analyse dieser Mutanten

-> 1 Gen- 1 Enzym Hypothese -> manche 

Enzyme bestehen aus mehreren Proteinen 

=> Neuformulierung: 1 Gen- 1 Polypeptid Hypothese

= Mangelmutanten, gegenüber der Ausgangsform (Elternformen, Wildtypzellen); durch vermehrte Ernährungsansprüche ausgezeichnete Mutanten

Zeigte das Alkaptonurie eine rezessive Erbkrankheit darstellt. Patienten scheiden Homogentisinsäure aus.

=> PAtienten können diese Säure nicht abbauen. 

-> Blockade in einem Metabolischen Prozess führt zu Anhäufung von Schadstoffen

Gene werden in RNA transkribiert.

RNA hat meist selbst schon eine Funktion, und wird nicht immer in ein Protein umgeschrieben.

Viele ncht codierende RNAs sind essentiell.

ribosomale RNA (rRNA): bildet Ribosom

small nuclear RNA (snRNA): katalytischer Teil des spliceosoms (RNA splicing)

small interfering RNA (siRNA): essentiell für RNA gesteuerte Interferenz

small nucleolar RNA (snoRNA): steuert Modifikation der RNA

Micro RNAs (miRNA): REguliert Translation und Stabilität von RNAs

short heterochromatic RNA (shRNA): Kontrolliert Stillegung von chromosomalen Regionen

= umschreiben von DNA in RNA

Im Zellkern: Enzyme (RNA Polymerase) lesen die DNA ab und erstellen eine Kopie in Form von RNA. 

RNa wird von 5´in 3´Richtung synthetisiert. (Ablesen des DNA Stranges von 3´in 5´Richtung -> Template Strang)

Coding Strang: nahezu ident zu RNA

=> Bildung von prä-mRNA

prä-mRNA wird von Enzyme zurechtgeschnitten und modifiziert.  Dadurch entsteht die reife mRNA. Danach kann der RNA-Strang aus dem Zellkern ins Cytoplasma transportiert werden.

Initiation, Elongation und Termination

Initiation der Transkription erfordert einen Promoter. Der Promotor bestimmt ORT und RICHTUNG der RNA-Neusynthese. Der Promotor und die kodierende Sequenz sind Teil eines Gens, d.h. bilden eine funktionelle Einheit.

Initiation:

In vitro kann bakterielle RNA-Polymerase von jeder Stelle die Transkription starten. Sigma Faktoren beschränken die Initiation auf Promotorregionen.

Elongation:

Nach entwinden der DNA fällt sigma Faktor herunter. RNA-Polymerase beginnt Transkription.

Termination: 

1. RHO (Helikase) abhängige Termination: C reiche Sequenz in der RNA erlaubt binden von Rho. Rho folgt der RNa Polymerase. Durch ATP-abhängiges Entwinden der RNA vom Template Strang dissoziiert die RNA.

2. Durch terminale Hairpins (Haarnadeln): Die Struktur verlangsamt die RNA Pol. Die folgenden U-reichen Sequenzen destabilisieren die RNA Interaktion mit dem Template Strang und die Polymerase dissoziiert.

Verschiedene s Faktoren sind für unterschiedliche Promotoren spezifisch

Gen: Promotor, Codesequenz und Terminator

Transkribierte RNA besteht aus einer 5’ untranslatierten Region, der Proteinkodierenden Sequenz, und einer 3’ untranslatierten Region. 5’ und 3’ Untranslatierte Region bestimmen die Stabilität und Translatierbarkeit einer RNA.

Eukaryotische RNA wird modifiziert, prozessiert, aus dem Kern exportiert und erst im Zytoplasma translatiert.

Transkriptoon beginnt an TATA Box. Pol 2 iwrd an TATA Box Stelle gebracht.

Pol 2 benötigt zusätzlich Promotoren und Enhancer.

TBP  und TFII (Transkriptionsfaktor) assemblieren an der TATA Box.

An RNA Pol 2 lagern sich immer mehr Transkriptionsfaktoren an. Zum Schluss verändert 1 Molekül die Ladung des Phosphorrests der Pol 2 (wird stark negativ). 

Polymerase löst sich aufgrund der negativen Ladung vom Komplex und beginnt die Transkription.

TFII H hat sowohl Helikase als auch Kinase Aktivität. Die Helikase entwindet die DNA. Die Kinase Phosphoryliert den C-Terminus von Pol I

rRNA: Bildung von Ribosomen (Bildung durch RNA Pol 1)

mRNA: codiert für Proteine (Bildung durch RNA Pol 2)

kleine nicht codierene RNAs: snRNA, tRNA, snoRNA (Bidlung durch RNA Pol 3)

Wenn ca 20 Nukleotide der RNA Synthetisiert sind, wird ein 5’ invertiertes methyl-Guanosin Cap durch ein “cappingEnzyme” angefügt. Die Zucker von Nukleotid 1 und 2 werden ebenfalls methyliert

Sequenzen am 3’ Ende der RNA werden erkannt (CPSF, CstF). In unmittelbarer Nähe wird die RNA gespalten durch CF I und CF II (cleavage factor I und II).

Polyadenylation erfolgt durch PAP (Poly A polymerase)

Eukaryotische Gene sind nahezu immer von nicht kodierenden Sequenzen (Introns) unterbrochen. Introns werden im Zellkern entfernt: prä-mRNA Spleissen

DNA: Thymin; stabile Speicherung; Desoxyribose; Doppelstrang

RNA: Uracil; nicht so stabil; Ribose: Einzelstrang

RNA Information wird am Ribosom (im Cytoplasma) in Proteine übersetzt.

Aminosäuren werden mit Peptidbindungen miteinander verknüpft. 

Initiation: 

Um die mRNA abzulesen, benötigen wir die Ribosomen und die tRNA. Ribosomen haben drei Bindungsstellen:

• die A-Stelle (Aminoacyl-Stelle)
• die P-Stelle (Polypeptid-Stelle)
• und die E-Stelle (Exit-Stelle).

Zunächst setzt sich das Ribosom an die mRNA an. Nun fährt es diese vom 5’Ende zum 3’Ende ab.

Das Ribosom wandert nun so lang an der mRNA entlang, bis es an eine bestimmte Abfolge aus drei Basen gelangt. Ein solches Basentriplett kannst du auch als Codon bezeichnen. Wenn das Basentriplett AUG (= Startcodon) erreicht wird, beginnt die Translation.

Nun setzt sich eine tRNA  (transport-RNA) an die mRNA. Im Gegensatz zur mRNA dient sie nicht als Bote der Erbinformation, sondern transportiert eine Aminosäure zu dem Basentriplett. Die tRNA hat die Form eines umgedrehten Kleeblattes. Am Ende des mittleren „Blattes“ befindet sich das Anticodon. Das ist das Basen-Triplett, das genau das Gegenstück zu dem Triplett auf der mRNA an der A-Stelle darstellt. Am Ende des „Stieles“ befindet sich die zum Anticodon gehörige Aminosäure. Die tRNA setzt sich nun an die A-Stelle im Ribosom.

Elongation:

Bei der Elongation wandert nun die mRNA weiter, sodass das ursprüngliche Codon und die ursprüngliche tRNA an der P-Stelle sitzen. Dadurch rutscht ein neues Basen-Triplett an die A-Stelle. Auch hier setzt sich die dazugehörige tRNA an. Die tRNA in der P-Stelle gibt nun ihre Aminosäure ab, welche sich an die Aminosäure in der A-Stelle bindet.

Die tRNA in der E-Stelle löst sich und verlässt das Ribosom.

Termination:

Sobald sich in der A-Stelle des Ribosoms ein Stopp-Codon befindet, wird die Translation abgebrochen. Das Stopp-Codon ist ein Basen-Triplett mit den Basen UAA, UAG oder UGA. 

Das Ribosom zerfällt in seine Untereinheiten und verschwindet wieder in das Cytoplasma.

- Erfordert elFs

- Benötigt keine Shine Dalgarno Sequenz weil Caps vorhanden sind

- mRNA muss ein Cap tragen (wenn RNA fertig synthetisiert wurde bekommt sie durch ein Capping- Enzym ein Cap)

1. elfs und eine mit met-tRNA beladene kleine Untereinheit der Ribosomen, scannt das 5' Ende der RNA bis zum ersten AUG (Start).

2. Nach Erkennen des AUGs bindet die große Einheit des Ribosoms an die kleine Untereinheit und die elfs werden bis auf das eIF4E entlassen. Dieser erkennt die Cap Struktur.

3. Ef-TU (Elongationsfaktor) wird benötigt damit tRNA an die a-site binden kann (1. Station)

4. tRNA mit Aminosäure ist in a-site→ die Peptidkette aus der p-Stelle wird an die neue AS von tRNA in a-stelle geknüpft und alle tRNAs rutschen um eine Stelle weiter Richtung Exit.

5. Leere tRNA wird durch e-site herausgeschleust

6. Nächste tRNA mit Aminosäure kommt ins Ribosom, gibt AS wieder an p-site ab und p-site verknüpft AS (Peptidyl-transferase Aktivität) durch Peptidbindung aneinander (Wiederholungsprozess)

7. Bis das tRNA Stopp Kodon gelesen wiederholt sich dieser Vorgang immer wieder 

Terminationskodons werden nicht durch tRNA erkannt. Statt einer tRNA bindet ein release factor RF. RF1 erkennt UAA und UAG, RF2 erkennt UAA und UGA (in Bakterien).

Bindung von ribosome recycling factor (RRF) erlaubt Bindung von EF-G und somit Translokation. Die zwei ribosomalen Untereinheiten dissoziieren.

Initiation wird von Initiationsfaktoren reguliert. Initiation Factor 1 und 3 binden die kleine ribosomale Untereinheit. Diese bindet das 5’-Ende der RNA Die rRNA Basenpaart mit der Shine-Dalgarno Sequenz der mRNA.

verifiziert  Shine Dalgarno Basenpaarung

ist ein Triplett Code. 3 Basen codieren für eine AS. redundant: mehrere Basentripletts könne für die geliche AS codieren.

Proflavin wurden den Stämmen hinzugefügt 

-> Hinzufügen oder Entfernen einzelner Basen führt zu Mutation und Bildung einer andere As

=> Bestätigung des Triplett-Codes

Eukaryotische und Prokaryotische Ribosomen sind sehr ähnlich. 

Eine ungenaue Basenpaarung welche zur Diversität der AS führt. (meistens an dritter Porition des Tripletts)

Bei Bakterien befinden sich zur Genregulation  spezielle Funktionseinheiten auf der DNA . Eine solche Einheit bezeichnest du als Operon. E. coli Bakterien besitzen beispielsweise ein sogenanntes lac Operon. Mit dessen Hilfe können sie Milchzucker aufnehmen und abbauen.

Lac steht dabei für Lactose und ist ein anderes Wort für Milchzucker. Die Verfügbarkeit des Zuckers reguliert dabei das An- und Abschalten bestimmter Gene. Das lac Operon (lac-Operon) ist ein Beispiel für das Operon Modell.

Schauen wir uns den Aufbau des lac Operons einmal genauer an. Grundsätzlich besteht ein Operon immer aus den drei folgenden Elementen: 

• Promotor: Bindestelle für die RNA-Polymerase bei der Transkription
• Operator: Bindestelle für Regulatorproteine zur Regulation der Transkription
• Strukturgene: Gene , die durch das Operon kontrolliert werden

Beim lac-Operon sind die Strukturgene für die Aufnahme und den Abbau der Lactose verantwortlich. Hier siehst du, für welche drei Enzyme die Gene codieren, also herstellen:

• lacZ: codiert für das Enzym -Galactosidase, es spaltet den Zweifachzucker Lactose in die Einfaachzucker Glucose und Galactose
• lacY: codiert für das Enzym Galactosid-Permease, es sorgt für die Aufnahme von Lactose in die Zellen
• lacA: codiert für das Enzym Galactosid-Transacetylase, seine Funktion ist bisher noch nicht bekannt

Zusätzlich findest du vor dem Operon noch ein Regulatorgen. Wie der Name schon sagt, ist es für die Regulation der Genexpression verantwortlich. In E. coli heißt das Gen lacI. Es ist immer aktiv und produziert den Lac Repressor. 

Das Tryptophan-Operon, kurz trp-Operon, ist ein Operon, das für die intrazelluläre Synthese von Tryptophan in Bakterien wie z. B. Escherichia coli eine zentrale Rolle spielt.

Aktiv ist dieses Operon, wenn die Zelle Tryptophan selbst herstellen muss, weil diese Aminosäure nicht ausreichend im umgebenden Medium vorliegt. Bei hinreichend hoher intrazellulärer Konzentration an Tryptophan wird das Operon dagegen in der Regel durch einen spezifischen Repressor inaktiviert.

Der von dem Regulatorgen transkribierte und von der mRNA translatierte Repressor bleibt so lange inaktiv, wie kein Tryptophan vorhanden ist um mit ihm eine Bindung einzugehen. Wenn Tryptophan hergestellt wurde bindet es an den Repressor, der dadurch aktiviert wird und an den Operator bindet. Somit reguliert Tryptophan seine Herstellung selbst, indem das Prinzip der negativen Rückkopplung angewendet wird.

Man spricht von einer Endproduktrepression, da das Produkt einer Synthese selbst auf diese indirekt einwirkt.

Die Strukturgene des trp-Operon sind:

• trpE
• trpD
• trpC
• trpB
• trpA

Kontrolle zum Abbau von Stoffen. Wenn substrat vorhanden ist wird Repressor verändert und kann nicht mehr binden.

Jede tRNA wird mit einer spezifischen Aminosäure beladen. Das Anticodon der tRNA basenpaart mit dem Codon der mRNA. tRNAs nehmen eine Kleeblattstruktur (durch Basenpaarungen) ein. Alle tRNAs haben eine CCA Sequenz an deren 3’ Ende. Diese Sequenz wird post-transkriptionell angefügt.

In gefaltetem Zustand nimmt die tRNA eine L-Form ein

belädt tRNAs unter ATP Verbrauch

Die Carboxyl Gruppe der Aminosäure bindet an das 3’ oder 2’ OH der tRNA

Experimentieren an lac-Operon

Jacob und Monod konnten mittels Mutationen eine Region als Operator (LacO) und eine als Repressor (lacI) identifizieren.

Cis Aktivität des Operators:

Mutationen zeigten, dass lacO in cis operiert (am gleichen Molekül)

Trans Aktivität des Repressors:

Mutationen in lacI zeigten, dass dieses in trans operiert (auch an anderen Molkülen)

Kontrolle zum Aufbau von Stoffen. Wenn das Endprodukt in ausreichender Konzentration vorhanden ist bindet das Endprodukt an den Repressor, wird zum Inducer und stoppt die Produktion, solange bis die Konzentration fällt und das Endprodukt vom Repressor.

Genregulation kann auf mehreren Ebenen erfolgen: •Transkriptionskontrolle

•Regulation des RNA-Processings

•RNA Stabilität

•Translationskontrolle

•Proteinstabilität

•Protein Modifikation

Je weiter oben in der Kaskade gelegen, desto verzögerter ist die Antwort auf ein Signal

Proteinmodifikationen erlauben eine unmittelbare Antwort auf einen Stimulus

Inducers und Repressors kontrollieren die Genexpression. Inducers sind oft kleine Moleküle (z.B. Metabolite). Diese kleinen Moleküle werden oft von DNA-bindenen Proteinen erkannt, welche als Aktivatoren oder Repressoren der Transkription wirken.

erfolgt über Aktivatoren, welche an DNA binden. Aktivatoren können Transkription auf verschiedene Arten stimulieren

1. Transkriptionsfaktoren bindem am Start= TATA Box mit Promotor.

2. Kontrollsequenz (enhancer) reguleirt die Genaktivität

3. Enhancer ist auf weitere Transkriptionsfaktoren (Aktivatoren) angewiesen um Transkriptionsrate zu steigern

4. Silencer reduzieren Transkriptionsrate

5. Falls nötig binden Aktivator/Repressor an die Transkriptionsfaktoren vom Promotor.

6. Mediator ist Bindungsstelle zwischen Aktivatoren/Repressoren und Promotor samt Transkriptionsfaktoren und TATA Box

2 Wege zur weiterleitung von Hormonen an die Zelle

1. Polypeptidhormon: An der Außenseite der Membran ist ein Repressor welcher mit dem Hormon bindet -> Startes Informationsweitergabe an Zellkern

2. Steroidhormon: Diffundiert durch Zellmembran, bindet in der Zelle an Rezeptor und dieser schleust Hormone in Zellkern

->Hsp 90 (Heat shock protein 90) um den Rezeptor verhindert die vorzeitige Aktivierung des Steroidhormon-Rezeptors im Cytoplasma. wenn ein Hormon in die Zelle eintritt löst es den Mantel und bindet selbst an den Rezeptor.

Histon Modifikationen können Transkription regulieren indem Chromatin mehr oder weniger zugänglich verpackt wird (längerfristiger Einfluss auf die Genregulation)

->Chromatin wird gelockert um Transkription zu starten

Teilweise werden Basen der DNA selbst modifiziert. (Bei Eukaryoten) Cytosin wird Methylgruppe angehängt 

-> dichtere Verpackung der DNA kann Transkription inhibieren